Copier et détecter la présence ou l'absence d'une séquence cible
Nous sommes souvent amenés à définir et comparer des méthodes de tests pour les utilisateurs industriels souhaitant faire évoluer et optimiser leurs programmes. LuminUltra Fournit le GeneCount® Appareils de PCR en temps réel (RT) de la série Q. Alors, comment ça marche? La réponse rapide est la suivante : la PCR (ou réaction en chaîne par polymérase) est une technique permettant de multiplier un brin spécifique d'ADN ou d'ARN des millions de fois en manipulant la machinerie naturelle de la cellule. La manipulation est une réaction thermochimique hautement contrôlée. « Une fois multiplié ou « amplifié », l'identifiant – l'ADN cible – peut être facilement détecté grâce à diverses méthodes en temps réel.
Mais comment ça marche? La PCR, telle qu'elle a été développée par le Dr Kary Mullis dans les années 1980, est un processus assez simple. La partie chimique consiste à prélever un brin ou un segment d'ADN (ce qu'il y a dans votre échantillon de test), à ajouter les éléments constitutifs qui forment les barreaux d'ADN (appelés dNPT), des amorces (petits segments d'ADN qui indiquent spécifiquement à la machinerie cellulaire par où commencer et arrêter de copier) et incorporer l'enzyme qui fabrique ou « polymérise » les brins d'ADN (c'est la partie « polymérase »). La partie thermo consiste à utiliser le dispositif PCR (GeneCount) pour faire un cycle entre les températures élevées et basses 30 à 50 fois, un processus appelé « thermocyclage ». LuminUltra's GeneCount® Appareils de la série Q cycle automatiquement entre les températures, vous permettant de vous asseoir et de vous détendre pendant que la magie opère.
Voici le protocole typique du processus :
1. Ingrédients du mélange PCR
Tout d'abord, vous aurez besoin d'un échantillon avec le segment d'ADN potentiel que vous souhaitez vérifier. Tout type d'ADN fonctionne pour cela – bactérien, animal, végétal, humain – au niveau le plus élémentaire, ils sont tous identiques. Deuxièmement, vous aurez besoin des éléments constitutifs de la vie (dNTP ou nucléotides qui sont les morceaux de code), d'un tampon et de cations. Plus important encore, vous aurez besoin de la polymérase – c'est votre scribe, la machinerie qui suit les brins d'ADN, reproduisant la séquence au fur et à mesure. Enfin, vous aurez besoin de quelques amorces. Ce sont de courts segments d'ADN qui peuvent se lier à un segment d'ADN simple brin et donner à la polymérase quelque chose à quoi s'accrocher lorsqu'elle commence à copier.
2. Faites chauffer le mélange
L'ADN est solidement emballé dans une formation en double hélice - deux brins qui s'enroulent l'un autour de l'autre en forme de bobine. Cela aide à protéger et à abriter la partie codée de l'ADN, mais sert en même temps à la cacher. Afin d'ouvrir cette hélice, vous ajoutez de la chaleur et les doubles brins d'ADN se désenroulent et vous obtenez deux brins simples séparés.
3. Refroidissez le mélange
L'ADN n'est pas la seule chose sensible à la chaleur. À ces températures élevées, la machinerie cellulaire n'est pas pleinement opérationnelle, mais elle se refroidit et les amorces commencent à se fixer aux segments d'ADN correspondants afin que la polymérase puisse effectuer des copies en cours de route.
4. Attendez un peu
Cela ne prend pas longtemps, de 10 à 30 secondes et cette polymérase vous aura fait une copie parfaite du segment d'ADN.
5. Répétez au besoin
Besoin de plus d'un exemplaire ? Répétez simplement le processus jusqu'à ce que vous ayez autant d'ADN que vous en avez besoin. Chaque cycle double la quantité d'ADN cible qui existe dans l'échantillon. Au fur et à mesure que le cycle se répète, le doublement du nombre de segments d'ADN fait de même. En raison de la puissance de la croissance exponentielle, vous obtenez rapidement un très grand nombre de copies d'ADN ; vous aurez 2,048 30 exemplaires après seulement les dix premiers cycles. Après 1 cycles ? Vous en aurez plus d'un milliard d'exemplaires. Oui, c'est un milliard, avec un « B ».
Vous vous demandez peut-être ce que vous faites avec toutes ces copies d'ADN. Vous pouvez faire beaucoup de choses, mais lorsque vous recherchez une cible spécifique d'ADN, par exemple Legionella pneumophila, vous ajoutez également de petites balises fluorescentes dans le mélange, appelées sondes. Lorsque vous ajoutez de l'énergie sous la forme d'une longueur d'onde de lumière spécifique, la partie fluorescente de cette sonde est excitée, laissant échapper un minuscule éclat de lumière dans une longueur d'onde différente, un peu comme un code Morse coloré. Un petit éclat de lumière, ou même 2, 4 ou 8, est trop petit pour que même l'instrument le plus sensible puisse le détecter.
Mais si vous avez un million d'exemplaires ? Un milliard? C'est une autre histoire. Lorsque votre instrument détecte la lumière, il la traduit en un « ADN TROUVÉ ICI ! » signal appelé unités lumineuses relatives (RLU). Plus il y a d'ADN, plus le signal est brillant. C'est ce qui fait que la courbe PCR classique augmente de façon exponentielle.
Au cas où vous seriez intéressé, la duplication ne dure pas éternellement. Chaque réplication utilise un peu des éléments constitutifs (nucléotides) ajoutés à la réaction ; une fois ceux-ci épuisés, essayez comme vous le souhaitez, la réplication se termine et la courbe PCR s'aplatit.
Comme vous pouvez l'imaginer, parce que la PCR recherche une correspondance exacte entre l'ADN cible et l'amorce, elle peut être très précise. Être capable de transformer une copie d'ADN en milliards permet à la PCR d'être très sensible. C'est un excellent outil pour détecter la présence d'agents pathogènes - ou de tout type d'ADN - à peu près n'importe où. C'est aussi incroyablement sûr car toute la chimie est inerte. Aucun organisme vivant n'est impliqué.
